Hvordan du uttrykker et menneskelig gen i E. coli?

Hvordan du uttrykker et menneskelig gen i E. coli?

E. coli brukes for å uttrykke humane gener, fordi det lett kan dyrkes i laboratoriet. Genet ekstraheres fra DNA (ved å gjøre en delvis fordøye med et restriksjonsenzym), og gitt en sammenhengende klebrig ende med en linker eller adapter. Den blir så ligert til et plasmid vektor, som hadde et restriksjonssete som er kompatibel med endene av genet, for eksempel hvis plasmidet inneholder en BamH1 område da man vil legge en linker eller adapter som er kompatibel med den 5'GGATCC3 'BamH1 gjenkjenningssekvens . Cellene blir transformert (laget for å ta opp plasmidvektoren) ved kjemisk behandling; de er blandet med plasmidet, og deretter en sterk konsentrasjon av kalsium (Ca2 +) ioner blir tilsatt til blandingen for å gjøre det E.coli-membraner porøs. Blandingen blir deretter oppvarmet for å varme-sjokk i cellene, til ca 50 ° C i ett minutt. De blir deretter avkjølt og tillatt å komme seg i et næringsrikt medium ved optimal temperatur. Dette er en meget ineffektiv prosess - bare om en celle i hver million er transformed.The pUC18 plasmid-vektor er nyttig fordi den inneholder genet for ampicillinresistens. Eventuelle celler som deretter vokser på et medium inneholdende ampicillin, og derfor har blitt transformert med plasmidvektoren. Det er også nyttig, fordi den inneholder en beta-galaktosidase-genet, som selv inneholder gjenkjennelsessetet for en rekke restriksjonsenzymer, inkludert BamH1. Dette er bra fordi du kan fortelle om vektoren har tatt opp genet er du prøver å uttrykke når vektor ikke lenger koder for beta-galaktosidase proteinprodukt. Dersom vektoren er ligert med genet, vil genet har forstyrret beta-galaktosidase-gen. Dette kan testes med IPTG (en auto-induser) og X-gal, som vil slå kolonier av E.coli med beta-galaktosidase-genet intakt blå (dvs. de som er uten genet av interesse). Kolonier som har fått sin beta-galaktosidase-genet ødelagt ved ligering av genet av interesse vil være farveløst, i nærvær av X-gal og IPTG.These kolonier blir alle klonale, slik at alle cellene i form av fargeløse kolonier inneholde kopier av vektoren pUC18 plasmid som er blitt ligert med det humane genet.